推荐以下用户使用该试剂盒:
- DNA的起始量较低
- 希望优化通量测序实验
- 需要控制读长
- 对靶向扩增子测序感兴趣。
PCR测序试剂盒(PCR Sequencing Kit)适用于当起始gDNA数量有限时的测序建库。
在Covaris g-TUBE 中将gDNA样本片段化。经剪切的末端通过NEBNext末端修复/ dA尾添加模块(NEBNext End Repair/dA-tailing module)进行修复和dA尾添加,再将含有引物结合位点的接头连接至制备好的末端上。之后进行扩增步骤,使用含由5’标签的引物以促进快速测序接头(Rapid Sequencing Adapter)的无连接酶贴附。
使用试剂盒需进行约50分钟的预PCR准备工作。PCR步骤各不相同(取决于循环数,聚合酶速度和模板长度)。标准步骤建议起始gDNA为100ng:可以使用更少量,但是可能需要增加PCR循环数。PCR后的步骤大概需要10分钟。
PCR测序试剂盒(PCR Sequencing Kit)特征:
特征 | 性质 |
制备时间 | 60分钟+PCR |
起始样本要求 | <100 ng gdna |
是否需要PCR | 是 |
片段化 | 可选 |
读长 | 等同于PCR后的片段长度 |
产生读长类型 | 1D |
典型通量* | ... |
相关实验方案 | PCR测序试剂盒(PCR Sequencing Kit) |
混样建库测序可选产品 | PCR 条码试剂盒(PCR Barcoding Kit) 芯片清洗试剂盒(Flow Cell Wash Kit) |
包装规格 | 6个反应 |
稳定性 | 运输温度:2–8°C 长期储存温度:-20°C |
兼容性 | 测序芯片: FLO-MIN106 FLO-MIN107 |
PCR后产生的片段长度取决于PCR中实用的输入物料长度,并受到DNA聚合酶持续合成能力的限制。这意味着,使用PCR测序试剂盒(PCR Sequencing Kit)可以获得更好的片段长度,相比之下,快速PCR条码试剂盒(Rapid PCR Barcoding Kit)只能达到~2 kb。因此,在起始物料有限(即需要使用PCR)但所需读长超过快速PCR条码试剂盒(Rapid PCR Barcoding Kit)所能达到的长度时,该试剂盒便可提供解决方案。
在使用PCR测序试剂盒(PCR Sequencing Kit)(A)和快速PCR条码试剂盒(Rapid PCR Barcoding Kit)(B)制备文库时均观察到了典型的读长直方图。
该试剂盒同时允许用户使用同一5’组对其自己的特异性扩增子打标签,简化了下游PCR后的处理流程。这是通过四引物PCR实现的。用户将5’尾添加至其自己的引物序列上,可作为一系列带条码“外延”引物(PCR条码试剂盒附带)的引发位点,这些引物包含5’标签,可以促进快速测序接头的无连接酶贴附。
进一步考虑:
除了用于生成更多的材料(在起始材料有限的情况下),PCR还可用于纯度不高的样本(不纯样本可抑制文库构建效率);PCR选择合适的分子作为为模板进行扩增。原始杂质丢失或稀释。在实验中可以经常看到,加入 PCR 步骤能够对产生较差测序结果的样本进行改善。在起始样本少于1ng的情况下,我们推荐进行全基因组扩增。
一个PCR条码试剂盒(PCR Barcoding Kit)可以对多达12个样本进行混样建库。
PCR测序试剂盒(PCR Sequencing Kit)适用于当起始gDNA数量有限时的测序建库。
在Covaris g-TUBE 中将gDNA样本片段化。经剪切的末端通过NEBNext末端修复/ dA尾添加模块(NEBNext End Repair/dA-tailing module)进行修复和dA尾添加,再将含有引物位点的接头连接至制备好的末端上。之后进行扩增步骤,使用含由5´标签的引物以促进快速测序接头的无连接酶贴附。
使用试剂盒需进行约50分钟的预PCR准备工作。PCR步骤各不相同(取决于循环数,聚合酶速度和模板长度)。标准步骤建议起始gDNA为100ng:可以使用更少量,但是可能需要增加PCR循环数。PCR后的步骤大概需要10分钟。
该试剂盒同时允许用户使用同一5´组对其自己的特异性扩增子打标签,简化了下游PCR后的处理流程。这是通过四引物PCR实现的。用户将5´尾添加至其自己的引物序列上,可作为一系列带条码“外延”引物(PCR条码试剂盒附带)的引发位点,这些引物包含5´标签,可以促进快速测序接头(Rapid Sequencing Adapter)的无连接酶贴附。
使用PCR测序试剂盒(SQK-PSK004)的实验方案样本 - 仅用于示范
PCR测序试剂盒(PCR Sequencing Kit)包含充足的试剂,足以构建6个测序文库。
同时提供测序芯片制备扩展包(Flow Cell Priming Expansion Pack)
额外购买PCR条码试剂盒(PCR Barcoding Kit)(SQK-PBK004)可进行多达12个样本的带条码混样建库。
耗材
英文 | 中文 |
Agencourt AMPure XP beads | Agencourt AMPure XP磁珠 |
NEBNext End repair / dA-tailing Module (E7546) | NEBNext末端修复/ dA尾添加模块(E7546) |
NEB Blunt/TA Ligase Master Mix (M0367) | NEB平末端/ TA连接预混液(M0367) |
1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tubes | 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind 离心管 |
0.2 ml thin-walled PCR tubes | 0.2 ml薄壁PCR离心管 |
Nuclease-free water (e.g. ThermoFisher, cat # AM9937) | 无核酸酶水(例如ThermoFisher,cat # AM9937) |
Freshly prepared 70% ethanol in nuclease-free water | 新制备的70%乙醇(用无核酸酶水配制) |
LongAmp Taq 2X Master Mix (e.g. NEB M0287) | LongAmp Taq 2X预混液(例如:NEB M0287) |
10 mM Tris-HCl pH 8.5 with 50 mM NaCl | 10 mM Tris-HCl pH 8.5 加50 mM 氯化钠 |
可选耗材
- Covaris g-TUBE
- Exonuclease I (NEB, M0293)
器材
英文 | 中文 |
Hula mixer (gentle rotator mixer) | Hula混匀仪(低速旋转式混匀仪) |
Magnetic rack | 磁力架 |
Microfuge | 低速离心机 |
Vortex mixer | 旋涡混匀仪 |
Ice bucket with ice | 装有冰的冰桶 |
Timer | 计时器 |
Thermal cycler | 热循环仪 |
P1000 pipette and tips | P1000移液枪和枪头 |
P200 pipette and tips | P200移液枪和枪头 |
P100 pipette and tips | P100移液枪和枪头 |
P20 pipette and tips | P20移液枪和枪头 |
P10 pipette and tips | P10移液枪和枪头 |
P2 pipette and tips | P2移液枪和枪头 |
可选器材
英文 | 中文 |
Agilent Bioanalyzer (or equivalent) | Agilent生物分析仪(或同等器材) |
Qubit fluorometer (or equivalent for QC check) | Qubit荧光定量仪(或用于质量检查的同等器材) |
Eppendorf 5424 centrifuge (or equivalent) | Eppendorf 5424 离心机(或同等器材) |