推荐以下用户使用该试剂盒:
- 想要优化测序实验,提高通量
- 需要控制读长
- 想要利用上游处理工序(比如,片段大小选择或全基因组扩增)的用户。
连接测序试剂盒(Ligation Sequencing Kit)提供的方法灵活,可使用dsDNA样本(比如,gDNA,cDNA或扩增子)来构建测序文库。构建文库的方法非常简单:通过使用NEBNext 末端修复/加dA 尾模块试剂盒(NEBNext End Repair/dA-tailing module)来进行DNA末端修复和dA尾添加,然后把试剂盒中提供的测序接头连接到制备好的DNA末端。
连接测序试剂盒(Ligation Sequencing Kit)特征:
特征 | 性质 |
制备时间 | 60分钟 |
起始样本要求 | 双链DNA 1000ng |
是否需要PCR | 否 |
片段化 | 可选;建议输入100-500ng |
读长 | 与片段长度一致 |
产生读长类型 | 1D |
典型通量* | ... |
相关实验方案 |
连接测序试剂盒(Ligation Sequencing Kit) 优质全基因组扩增 序列捕获 Blue Pippin长读长选择 |
混样建库测序可选产品 |
无扩增条形码试剂盒扩展包1-12(Native Barcoding Expansion 1-12) PCR条码试剂盒扩展包1-12和1-96(PCR Barcoding Expansion 1-12 and 1-96) 芯片清洗试剂盒 (Flow Cell Wash Kit) |
包装规格 | 6个反应 |
稳定性 | 运输温度:2–8°C 长期储存温度:-20°C |
兼容性 | 测序芯片: FLO-MIN106 FLO-MIN107 |
该试剂盒已针对产生最大通量进行了优化。如需获得最高数据产量,我们建议纯DNA的起始量为200 fmol。开始时使用更低量的起始样本或不纯样本,可能会影响文库构建效率且降低测序通量。
用户可以首先使用1μg的gDNA(使用Qubit荧光定量仪进行定量)或100-200fmol较短输入片段,如扩增子或cDNA。若实验需要长读长,则推荐首先使用全长gDNA,不推荐也不需要片段化/剪切。请注意:若需要长读长,则起始样本中必须存在长片段。建议使用Nanodrop测量A260/280和A260/230比率以确定样本纯度,建议样本应符合以下标准:
· A260/280 = 1.8
· A260/230 = 2.0-2.2
连接测序试剂盒(Ligation Sequencing Kit)可与上游处理工序兼容,例如,通过序列捕获进行靶向富集、全基因组扩增(适用于样本起始量少于1ng的应用)和片段大小选择(例如,使用BluePippin富集特定长度片段)。由于片段大小选择的过程可能会耗费样本,建议增加使用的样本起始量。
在通过使用连接测序试剂盒(Ligation Sequencing Kit)(含或不含g-TUBE片段化)或片段大小选择(无片段化)构建大肠杆菌(E.coli)文库时观察到的相对测序产量(A)和典型读长长度直方图(B,C和D)。
无需PCR和WGA的工作流程可以消除扩增偏好性,保留碱基修饰信息,用户可以通过使用Nanopore Community开发的相关软件来对该信息进行分析。
进一步考虑:
在开始时使用更低量的起始样本或不纯样本,可能会影响文库构建效率并降低测序通量。在样本量有限的情况下,可用PCR生成更多的起始样本材料。此外,在样本不纯和文库构建效率低下的情况下,PCR将选择合适的分子作为模板进行扩增。原始杂质被丢失或稀释。我们经常可以看到,测序结果不佳的样本可以同通过加入PCR步骤而得到改善。但是,如果PCR方法为文库构建的主要方法,则建议使用PCR扩增测序试剂盒(PCR Sequencing Kit),或是快速PCR条码试剂盒(Rapid PCR Barcoding Kit)。
虽然任何dsDNA都可以用作连接测序试剂盒(Ligation Sequencing Kit)的模板,但如果用户计划定期对扩增子或cDNA进行测序,应考虑使用附带有专用方案的特定试剂盒,以简化实验室工作流程并获得优质的结果。如果使用扩增子,推荐联合使用我们的四引物PCR实验方案(four-primer PCR protocol)和PCR扩增测序试剂盒(PCR Sequencing Kit)。若需要进行扩增子的混样文库测序分析,请使用PCR条码试剂盒(PCR Barcoding Kit)。若为cDNA,推荐使用cDNA-PCR测序试剂盒(cDNA-PCR Sequencing Kit)或cDNA直接测序试剂盒(Direct cDNA Sequencing Kit)。
Oxford Nanopore technologies视该产品的使用寿命为自客户收到产品之日起的3个月。
连接测序试剂盒(Ligation Sequencing Kit)提供的方法灵活,可使用dsDNA样本(比如,gDNA,cDNA或扩增子)来构建测序文库。构建文库的方法非常简单:通过对DNA末端进行FFPE修复(FFPE repaired)并使用NEBNext 末端修复/加dA 尾模块试剂盒(NEBNext End Repair/dA-tailed)来进行DNA末端修复和dA尾添加,然后把试剂盒中提供的测序接头连接到制备好的DNA末端。
使用连接测序试剂盒(SQK-LSK109)的实验方案样本 - 仅用于示范
连接测序试剂盒附带足够的试剂,可用于构建6个测序文库。
同时提供测序芯片制备试剂盒(Flow Cell Priming Kit)。
如果额外购买以下产品,可以实现对多达12个样本进行无PCR带条形码标签的混样文库测序:
无扩增条码扩展包1-12(Native Barcoding Expansion 1-12)(EXP-NBD103)。
如果购买以下产品,可以实现对多达12个样本进行基于PCR带条形码标签的混样文库测序:
PCR条码试剂盒(PCR Barcoding Kit)(SQK-PBK004),或 快速PCR条码试剂盒(Rapid PCR Barcoding Kit)(SQK-RPB004)
如果额外购买以下产品,可以实现对多达96个样本进行带条形码标签的混样文库测序(需要使用PCR):
PCR条码扩展包1-12(PCR Barcoding Expansion 1-12)(EXP-PBC001),或 PCR条码扩展包1-96(PCR Barcoding Expansion 1-96) (EXP-PBC096)。
耗材
英文 | 中文 |
Agencourt AMPure XP beads | Agencourt AMPure XP磁珠 |
NEBNext FFPE Repair Mix (M6630) | NEBNext FFPE修复混合液(M6630) |
NEBNext End repair / dA-tailing Module (E7546) | NEBNext末端修复/ dA尾添加模块(E7546) |
NEBNext Quick Ligation Module (E6056) | NEBNext快速连接模块(E6056) |
1.5 ml Eppendorf DNA LoBind tubes | 1.5 ml Eppendorf DNA LoBind 离心管 |
0.2 ml thin-walled PCR tubes | 0.2 ml薄壁PCR离心管 |
Nuclease-free water (e.g. ThermoFisher, cat # AM9937) | 无核酸酶水(例如ThermoFisher,cat # AM9937) |
Freshly prepared 70% ethanol in nuclease-free water | 新制备的70%乙醇(用无核酸酶水配制) |
可选耗材
英文 | 中文 |
Covaris g-TUBE (for fragmenting input amounts between 100 and 500 ng) | Covaris g-TUBE(适用输入片段为100-500ng) |
器材
英文 | 中文 |
Covaris g-TUBE (for fragmenting input amounts between 100 and 500 ng) | Covaris g-TUBE(适用输入片段为100-500ng) |
Hula mixer (gentle rotator mixer) | Hula混匀仪(低速旋转式混匀仪) |
Magnetic rack | 磁力架 |
Microfuge | 低速离心机 |
Vortex mixer | 旋涡混匀仪 |
Thermal cycler at 20° C and 65° | C 20° C 及65° C 热循环仪 |
P1000 pipette and tips | P1000移液枪和枪头 |
P200 pipette and tips | P200移液枪和枪头 |
P100 pipette and tips | P100移液枪和枪头 |
P20 pipette and tips | P20移液枪和枪头 |
P10 pipette and tips | P10移液枪和枪头 |
P2 pipette and tips | P2移液枪和枪头 |
Ice bucket with ice | 装有冰的冰桶 |
Timer | 计时器 |
可选器材
英文 | 中文 |
Agilent Bioanalyzer (or equivalent) | Agilent生物分析仪(或同等器材) |
Qubit fluorometer (or equivalent for QC check) | Qubit荧光定量仪(或用于质量检查的同等器材) |
Eppendorf 5424 centrifuge (or equivalent) | Eppendorf 5424 离心机(或同等器材) |
其他物料以用于:
长读长1D测序选择:
英文 | 中文 |
BluePippin device and gel cassette | BluePippin 设备及凝胶试剂盒 |
PCR条码 (带12或96条码扩展包)
英文 | 中文 |
LongAmp Taq 2X Master Mix (e.g. NEB cat # M0287) | LongAmp Taq 2X预混液(例如:NEB cat # M0287) |
Magnet for 96 well plates (for 96 barcodes) | 96孔板磁体(用于96条形码) |
Multi-channel pipette (for 96 barcodes) | 多通道移液枪(用于96条形码) |
0.2 ml 96-well PCR plates and seals (for 96 barcodes) | 0.2 ml 96孔PCR板和密封膜(用于96 条形码) |
高端全基因组扩增
英文 | 中文 |
Qiagen REPLI-g Midi Kit | Qiagen REPLI-g Midi 工具包 |
T7 Endonuclease I (NEB, cat # M0302) | T7 核酸内切酶 I (NEB, cat # M0302) |
TE buffer: 10 mM Tris (pH 8.0), 0.1 mM EDTA | TE缓冲液:10 mM Tris (pH 8.0), 0.1 mM EDTA ? |
PEG 8000, 50% w/v | PEG 8000, 50% w/v |
0.5 M EDTA, pH 8 | 0.5 M EDTA, pH 8 |
5 M NaCl (Sigma, cat # 71386) | 5 M NaCl (Sigma, cat # 71386) |
1 M Tris-HCl pH 8.0 | 1 M Tris-HCl pH 8.0 |